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成功的IHC/ICC实验操作指南(五)

实验的每一小步,都是决定结果的一大步。本期将为大家讲解IHC/ICC实验中一抗的选择和优化,喜欢的话就继续往下看吧!

在设计IHC/ICC实验时,一抗的选择是最重要的因素。而一抗的关键特征是抗原表位的特异性。IHC/ICC实验的所有步骤都必须经过优化,以便观察到特异染色,并尽可能减少非特异的背景染色。这包括开展预实验,以确定每个一抗的适当孵育条件。抗原亲和纯化的多克隆抗体的稀释度通常低于单克隆抗体,但这些值必须根据经验确定。为了获得可靠特异的信号,应当采用交叉反应性极少的高质量抗体。

1 一抗供应商的选择

在搜索一抗时,产品很可能有几个不同的商业来源,而它们的抗体质量可能参差不齐。最初的选择也许决定了这是个成功的实验,抑或是个错失的机会。第一步是寻找独立验证。这包括在文献中检查抗体过去是否成功使用。许多供应商(包括R&D Systems)都可以为寻找这信息的研究人员提供协助。另一个问题是询问抗体是否真的由供应商制造,还是它采购了之后转售?直接购买确保了供应商对制造、质量控制流程、以及运输和储存条件的完全控制。此外,一旦抗体的使用出现问题,制造商是提供优质技术服务的最佳选择。

2 单克隆还是多克隆

单克隆和多克隆抗体的内在特征决定了它们用于IHC/ICC时的优势和限制。单克隆抗体由单个B细胞克隆产生,代表了同质群体,能够高亲和力高特异性地与单个表位结合。这在检测蛋白家族的某个成员时特别有用,因为蛋白家族有着高比例的氨基酸同源性。

抗体结合往往依赖于目标蛋白维持其天然的构象状态。与其他蛋白的相互作用、翻译后修饰、温度、pH、固定和盐浓度都会影响抗体接近目的表位。多克隆抗体是异质的,可识别多个表位,因此它们较少受到蛋白构象变化的影响。一般而言,多克隆抗体在一定pH和盐浓度范围内也比单克隆抗体更为稳定。基于这些原因,多克隆抗体更常用于IHC/ICC实验。

3 多克隆抗体的亲和纯化

多克隆抗血清是抗体混合物,它们由大量B细胞克隆产生。组成多克隆抗血清的抗体以不同的特异性和亲和力与目标表位结合,也与不相关的目标分子交叉反应(非特异相互作用)。为了富集与目的抗原特异性和亲和力最高的抗体,R&D Systems的多克隆抗体经过抗原亲和纯化。在此过程中,多克隆抗血清流过固定了抗原分子的亲和柱。特异抗体被固定了的抗原保留,而非特异抗体流过柱子,被丢弃。随后从柱子上洗脱经抗原亲和纯化的抗体。抗原亲和纯化的抗体主要与目的抗原相互作用,降低了背景染色,与未纯化抗体相比产生了更一致的结果。

单克隆和多克隆抗体结合的区别。单克隆抗体只与单个表位结合,而多克隆抗体与同一个蛋白的不同表位结合。

4 一抗孵育条件的优化

抗浓度、稀释液、孵育时间和温度都影响染色质量。这些变量需要针对每个抗体和样品来优化,以便实现特异染色和低背景。优化通常是保持孵育时间和温度不变,而改变抗体浓度,以确定何时获得最佳信号和低背景噪音。例如,如果使用高亲和力的抗体,那么相对较高的浓度可能需要较短的孵育时间。相反,较低的抗体浓度可能需要较长的孵育时间。人们通常采用较长的孵育时间,以确保抗体完全渗透到组织切片。为了促进特异染色,较长时间的孵育通常在低温下开展(即4°C vs.室温)。

R&D Systems组织切片染色方案的优化首先是一抗在4°C孵育过夜对于细胞染色,通常选择在室温下与一抗共同孵育1小时。抗原亲和纯化过的多克隆抗体的工作浓度(1.7-15μg/mL)通常比单克隆体(5-25μg/mL)要低。在比较不同浓度的相同抗体染色的样品时,在孵育步骤时必须使用一致的时间和温度。当第一次使用新抗体时,建议开展预实验,检验各种抗体浓度

5 一抗孵育的起始条件

 

以上文字和图片来源于Bio-techne。

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