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成功的IHC/ICC实验操作指南(三)

实验的每一小步,都是决定结果的一大步。本期将为大家讲解IHC/ICC实验中固定步骤的要点,喜欢的话就继续往下看吧!

固定

IHC和ICC实验中所有样品都必须固定,以保护组织形态和目标分子的抗原性。固定会改变组织的化学组成,在保护组织结构和维持抗原表位之间常常需要进行权衡。细胞或组织固定不充分给蛋白在组织内快速降解留下了机会,这会影响特异性的免疫反应。然而,过度固定会遮蔽抗原表位或导致很强的非特异性的背景染色,掩盖特异性染色。固定的方法和顺序必须在样品准备的时候考虑到,另外,时间、温度和pH值也会影响固定的程度。

1.甲醛

甲醛是用于保存组织和细胞中目标蛋白的最常用的固定剂。一般认为甲醛介导的组织固定取决于蛋白和蛋白或蛋白和核酸之间的亚甲基(-CH2-)交联的形成。甲醛可以将NH2(氨基)和CONH(肽基)、NH2和NH或NH2和NH2化学交联在一起。

对于大多数IHC/ICC应用来说甲醛是个不错的选择,但并不是通用的固定剂。甲醛的过度固定会改变抗原表位中的氨基酸并阻止抗体的结合。不过,大多数情况下可以使用抗原修复试剂修复抗原的表位并恢复和抗体的结合。甲醛会导致磷酸依赖型的表位从膜转移到胞质溶胶中。在这种情况下,冰冷的无水甲醇或无水乙醇则是合适的固定剂。

抗原修复液

注意:虽然有许多种不同的固定剂,甲醛仍然是最常用,并且对于大多数IHC/ICC实验来说是合适的初始选择。甲醛溶液应当分装并冷冻保存,在4-8℃下储存不超过一个月。

2.醇

细胞和组织固定最常用的醇类是甲醇和乙醇。甲醇和乙醇的分子结构和水很接近。因此,它们能够和水竞争蛋白质中的氢键,替代组织中的水分子。这会减少蛋白质的介电常数,使其在等电点处沉淀,并且由于蛋白构象的变化,这会阻止抗体和其表位的结合。虽然醇会破坏蛋白质的疏水相互作用并影响到其三级结构,却似乎能够稳定蛋白质的二级结构。

然而,通常认为醇对组织形态的保护不如甲醛类固定剂。醇的穿透能力不如甲醛,主要用于固定冰冻组织切片和细胞。因此,醇固定更适合于细胞膜表面抗原。醇固定之后不建议进行抗原修复,因为通常认为这样的处理太剧烈,很有可能破坏组织切片或细胞的完整性。

3.丙酮

丙酮是强脱水剂,会引起组织蛋白的不可逆沉淀,通常用于未固定的速冻组织,丙酮处理之后再用醇或甲醛固定。

4.组织固定

当研究小动物如小鼠、大鼠和豚鼠的完整组织时,全动物灌流固定往往是保存抗原的最佳方法。这种方法是用固定剂来替代动物全身的血液。但是,对于所感兴趣的组织的固定,动物灌流不一定充分。在这种情况下,可以将剥离出来的组织浸泡在固定剂中。PBS溶解的4%的甲醛是组织的灌流和浸润固定的常用溶剂。

为了增强固定剂的穿透作用,组织最好不要超过10mm厚。对于完固定,固定剂的体积应当超过组织体积的50-100倍。固定通常在室温下进行4-24小时。固定条件的优化非常重要,因为固定不足或过度固定都会减少或破坏组织的免疫反应。

5.细胞固定

与组织样品相比,细胞的固定所需时间更短,可以使用浓度更低的固定剂。例如,用2%的甲醛溶液在室温下固定20分钟就足以保存细胞形态和抗原性。

细胞的固定通常就只需要去掉培养基并加入固定剂。然而,去除培养基之后表面张力的变化会破坏某些类型的细胞。如果这样的话,可以在培养基中直接加入固定剂。例如加入和培养基等体积的4%的甲醛即得到2%的甲醛溶液,足以对细胞进行预固定。两分钟后,换掉预固定培养基,加入新鲜的2%的固定剂。预固定的处理使细胞更加坚固,可以承受表面张力的变化造成的破坏性效果。

注意:固定会导致组织蛋白的疏水性交联。交联的程度取决于时间、温度、pH和所用的固定别。一旦固定方案经过优化,应当保持操作的致性。

 

以上文字和图片来源于Bio-techne。

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