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Western中的那些一知半解

Western Blotting即免疫印迹实验,用于蛋白质的定性分析,同时能够粗略的估计蛋白质的分子量大小,可谓生物实验的必备技能,传统的Western实验流程包括转膜、一抗杂交、二抗杂交、显色。根据二抗标记的不同可分为酶标二抗和荧光二抗,常见的用于标记二抗的两种酶是HRP辣根过氧化物酶和AP碱性磷酸酶,荧光二抗一般多用Cy3或者Cy5标记。
 

HRP标记时显色多用ECL试剂,即底物鲁米诺和过氧化氢,HRP催化鲁米诺产生多步氧化反应,使之从基态跃升至激发态并伴随产生428nm的低强度发射光,可以利用CCD或胶片进行检测,ECL检测灵敏度极高,目前多个厂商正在挑战fg级别。另外有小伙伴会问DAB也可用于HRP标记的显色,为什么应用在Western里面很少呢?尽管DAB显色可以产生棕红色的可见条带非常利于观察,但是DAB显色灵敏度较低,对底物的量要求在500pg以上,所以多用于组化显色。还有一种AP碱性磷酸酶标记的二抗多用BCIP/NBT试剂盒进行显色,BCIP在碱性磷酸酶的作用下水解,水解产物和NBT发生反应产生肉眼可见的不溶物,形成有颜色条带,加水后可以终止反应(小编依然清楚的记得第一次做AP显色看到条带时激动的拿着洗瓶挥舞的自我),BCIP/NBT显色灵敏度在100pg左右。这下知道为什么大多的客户都选择ECL显色了吧,毕竟高丰度的蛋白没那么多哦。

荧光二抗用起来就非常方便了,二抗上直接带标记,所以直接拿去曝光显色,一张膜可以同时杂两个抗体,不用为内参而裁膜的感觉真好。

2019年的第一个心愿就是把2018年没有解决的,本该在2017年就该完成的Western实验解决掉。本期内容要帮助大家把Western这个实验的坑填一填,那就从转膜开始吧!

1、转 膜

1. PVDF膜和NC膜区别在哪?

答:通常,PVDF膜蛋白吸附能力强,而NC膜背景更干净;PVDF膜由于疏水等原因,所以使用前需要100%甲醇浸润;NC膜使用方便但比较脆。如果蛋白丰度较低,推荐使用PVDF膜。

2. 膜有多种孔径,该如何选择?

答:最常用的膜孔径是0.45 μm,适合检测分子量>20kDa的蛋白。0.2 μm 孔径适合检测10-20kDa之间的蛋白。0.1 μm 孔径适合检测<10kDa的蛋白。

3. PVDF膜可以反复杂交么?

答:对于PVDF膜上的大部分蛋白,在stripping后重新封闭杂交,仍然能够进行显色出条带。

4. 湿转和半干转如何选择?

答:半干转时间短速度快,试剂耗费少,但前期需要几次的摸索,且不同的半干转印仪器转印条件相差较多。湿转成功率高,但相对费时,可根据实验条件和个人喜好来选择合适的方案。

2、封 闭

1. 选择脱脂奶粉还是BSA?

答:通常,磷酸化蛋白的检测使用BSA进行封闭,普通蛋白脱脂奶粉即可,尽量选择高品质的脱脂奶粉,减少抗体淬灭及非特异条带。

2. 封闭失败案例!

答:刚参加工作的时候,接到客户电话说显色没条带,一直都在帮客户排查样品和抗体的问题,一直未解决,直到一日翻看客户发过来的图片,发现5%脱脂奶粉的玻璃瓶里微微发绿(其实就是长菌了)。猜想客户是配了一瓶奶粉放冰箱里,随用随取?果不其然,客户说一直都是这样做的啊,以前的蛋白条带都没问题。小编当时差点一口老血喷出一丈远,亲,咱不差这点奶粉,长菌了就不要再用了!

 

3、一 抗

1. 一抗选择的时候注意哪些问题?

答:通常,优先选择单克隆抗体,非特异性条带少。除少量标签抗体外,务必注意物种特异性,尽量选择文献中使用较多的抗体。

2. WB的一抗为何很少有直接带HRP标记的呢?

答:首先由于一抗生产周期较长,成本较高,利用化学反应标记基团损失大量抗体的同时会降低抗体的亲和力,其次样品中目标条带的量较少,所以一抗结合后信号强度较低,显色时条带很弱。而流式抗体直标较多,且标记的荧光基团信号如FITC,PE等,其信号强度大且易于检测。

 

4、二 抗

1. 二抗选择的时候注意哪些问题?

答:通常,二抗选择首要问题是种属特异性,一抗如果是兔抗,那么二抗可以选择羊抗兔,鼠抗兔等。选择亲缘性较远的种属,能够显著提高特异性。

2. 二抗的主要作用是?

答:结合一抗的同时,把一抗信号级联放大很多倍,并且二抗上带有HRP等标记,可以进行显色反应。把微弱的信号放大到可供检测的范围内。二抗一般结合在一抗的FC区,不会竞争性的结合在一抗的V区。

5、显 色

1. 显色液如何使用和保存?

答:通常将AB液充分混合后,按照膜面积进行配置,注意效期避光保存。

2. 显色没条带怎么办?

答:在确定样品,抗体等均无问题后,选择灵敏度高的显色液,fg级别的显色液能够针对低丰度的蛋白进行有效显色。

文中图片来源:GE官网

 

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